l 細(xì)胞鑒定

種屬鑒定已通過

l 細(xì)胞來源

國家資源庫

l 細(xì)胞背景

細(xì)胞轉(zhuǎn)染了表達(dá)多瘤病毒中T抗原的NTKmT逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。觀察到血管性血友病因子的表達(dá)及對熒光標(biāo)記的低密度脂蛋白（LDL）的攝入確認(rèn)其內(nèi)皮細(xì)胞特性。bEnd.3 cells細(xì)胞可用細(xì)胞因子和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的Peyer's結(jié)高內(nèi)皮細(xì)胞受體，粘膜血管定居因子(MAdCAM-1) 及內(nèi)皮細(xì)胞選擇素的表達(dá)。腫瘤壞死因子 a (TNF alpha), 白介素 1 (IL-1)或 LPS的誘導(dǎo)作用是濃度及時間依賴的。代數(shù)較早的bEnd.3細(xì)胞未受刺激時在表面表達(dá)MAdCAM-1，但過了30代后就不表達(dá)了。細(xì)胞粘附分子 1 (ICAM-1)持續(xù)表達(dá)，并在LPS, IL-1 and TNF a處理后升高。30代前血管細(xì)胞粘附分子1 (VCAM-1)持續(xù)表達(dá)，但30代后不表達(dá)。 bEnd.3細(xì)胞中腫瘤壞死因子a (TNF alpha)可以誘導(dǎo)P-選擇素的表達(dá)，30代后更強。 

l 細(xì)胞特性

1） 來源：BALB/c小鼠腦

2） 形態(tài)：內(nèi)皮細(xì)胞樣  貼壁生長

3） 含量：>1x106  細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用。

l 培養(yǎng)條件：

1） 準(zhǔn)備DMEM ( 推薦awcell-128-0001含NaHCO3 1.5g/L；GIBCO,貨號12800017，添加NaHCO3 1.5g/L) 培養(yǎng)基，優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%，雙抗 1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

l 注意事項：

注意：（bEnd.3細(xì)胞對培養(yǎng)基pH值的任何不平衡都很敏感。使用配方含有3.7 g / L碳酸氫鈉的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞時為穩(wěn)定培養(yǎng)基PH值，增加CO2是必要的，否則這些細(xì)胞不會很好地附著或增殖，細(xì)胞建議在空氣，90%、二氧化碳，10%環(huán)境中培養(yǎng)。經(jīng)驗證在空氣，95%；二氧化碳，5%的環(huán)境下使用含1.5 g / L碳酸氫鈉的DMEM培養(yǎng)基會比較好，推薦使用含1.5 g / L碳酸氫鈉的DMEM培養(yǎng)基+優(yōu)質(zhì)胎牛血清10%來培養(yǎng)。

對于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。 

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的*培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實驗使用。

l 運輸形式：

低溫：（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

常溫（2） T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

l 生物安全:

1. 所有動物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2. 建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時始終使用防護手套、衣服和戴上防護面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會泄漏，并會慢慢充滿液氮。解凍時，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚的碎屑造成人員傷害。