l 細(xì)胞鑒定

STR鑒定已通過

l 細(xì)胞來源

國(guó)家資源庫

l 細(xì)胞特性

1.來源：骨髓

2.形態(tài)：圓形，懸浮生長(zhǎng)

3.含量：>1x106  細(xì)胞數(shù)

4.規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5.用途：僅供科研使用。

l 培養(yǎng)條件：

1）準(zhǔn)備1640培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

l 注意事項(xiàng)：

1. 細(xì)胞復(fù)蘇或傳代后會(huì)有少部分的細(xì)胞貼壁和部分懸浮的細(xì)胞，復(fù)蘇兩天后細(xì)胞會(huì)從貼壁細(xì)胞向外開始生長(zhǎng)，有時(shí)細(xì)胞再生長(zhǎng)過程中，細(xì)胞會(huì)再貼壁細(xì)胞的上方生長(zhǎng)，形成不同的細(xì)胞層，這種情況會(huì)有發(fā)生。 在細(xì)胞復(fù)蘇的一周內(nèi)，培養(yǎng)瓶中 通常會(huì)有懸浮的活的細(xì)胞團(tuán)，在換液過程中不要丟棄在這些活的懸浮細(xì)胞，可以通過離心（125×g）回收細(xì)胞，重新打回到培養(yǎng)瓶中，分離或者丟棄漂浮的活細(xì)胞會(huì)使細(xì)胞數(shù)量變少，引起細(xì)胞的停滯生長(zhǎng)或細(xì)胞死亡。

2.培養(yǎng)條件的細(xì)微變化，尤其是pH和培養(yǎng)基中血清的質(zhì)量，可能會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，在細(xì)胞的生長(zhǎng)過程中會(huì)有細(xì)胞內(nèi)的液泡出現(xiàn)，特別在細(xì)胞快要融合是會(huì)出現(xiàn)這種情況。培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)使用未被滅活的高質(zhì)量、低內(nèi)毒素的胎牛血清，可以使細(xì)胞更好的貼壁和形成單層細(xì)胞。

3. 細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中可以通過將血清濃度提到到20%來改善細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢的情況。（參考atcc 有關(guān)該細(xì)胞的描述）

l 細(xì)胞培養(yǎng)：

1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL*培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml*培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，半數(shù)培養(yǎng)基離心重懸后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3） 細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。下面T25瓶為例；

1.細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml.

2.1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每1ml凍存液含1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3.將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

l 運(yùn)輸形式：

低溫：（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

常溫（2） T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

l 生物安全

 1. 所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2. 建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套、衣服和戴上防護(hù)面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會(huì)泄漏，并會(huì)慢慢充滿液氮。解凍時(shí)，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險(xiǎn)力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚(yáng)的碎屑造成人員傷害。